T/NAASS 057-2023 牛4型疱疹病毒间接酶联免疫吸附试验 抗体检测技术规程

内容简介

本文件规定了牛4型疱疹病毒间接酶联免疫吸附试验抗体检测的术语和定义、间接酶联免疫吸附试验
本文件适用于牛血清、牛血浆、牛奶样本中牛4型疱疹病毒病抗体的检测，可用于该病的实验室检测、诊断和流行病学调查
3　术语和定义下列术语和定义适用于本文件。牛4型疱疹病毒Bovineherpesvirus4，BoHV-4牛4型疱疹病毒属于疱疹病毒科丙型疱疹病毒亚科猴病毒属，是导致牛生殖障碍的主要病毒之一。间接酶联免疫吸附试验Indirectenzymelinkedimmunosorbentassay,iELISA间接ELISA方法是先将抗原结合到ELISA板上，随后分两步进行检测，首先加入检测抗体与抗原特异性结合，随后加入酶标二抗检测并利用底物显色,由呈色反应来测定抗原。4　间接酶联免疫吸附试验操作试验准备实验环境、仪器与设备、洗液的制备、稀释液的制备、示踪剂工作液的配制按照试剂盒说明书规定执行。实验环境的生物安全条件应符合GB/T19489的要求，稀释用蒸馏水应符合GB/T6682的要求。检测样品新鲜或冷冻的血清、血浆、奶样均可直接用于检测。奶样准备：4000rpm/min离心20min，利用巴斯德吸管吸取中间层液体，注意不要接触到下层的细胞沉淀物。未稀释的脱脂奶可直接加入微孔板。操作程序使用前将所有试剂恢复至21℃±3℃，轻轻摇动或旋转，使试剂混合均匀。4.3.1　准备取出微孔板，并在操作记录表上标记样品的位置。如果使用微孔板的一部分，则只需取出足够检测样品的条数。未使用的微孔板条用锡箔纸包好，保持干燥与密封，2℃～8℃保存。4.3.2　血清或血浆稀释血清或血浆按试剂盒要求稀释，避免使用溶血样品和具有凝结物的样品。在试剂盒的微孔板中按要求加入样品、稀释液，吹打混匀。4.3.3　对照样品（阳性血清和阴性血清）和示踪剂稀释阳性血清、阴性血清及示踪剂应用稀释液按试剂盒要求进行稀释。4.3.4　加样每孔加入样品（血清、血浆或奶样），一孔一样。阳性血清加入A1孔，阴性血清加入A2孔，示踪剂加入A3孔，样品1加入A4孔，以此类推。4.3.5　感作将微孔板封板后，按照试剂盒说明书中指定的时间进行室温孵育。4.3.6　洗涤弃去微孔板中液体，用300μL左右的洗涤液洗涤每个板孔3次。在每一次洗涤后，甩去每个板孔中的液体，在洗涤时以及在加入下一步试剂之前要防止反应板出现干燥现象，避免孔内产生气泡，在最后一次甩掉后，在吸水材料上用力扣板，吸去剩余的液体。4.3.7　稀释酶结合物将酶结合物用稀释液按要求进行稀释。4.3.8　加酶结合物每孔加入酶结合物，摇匀。将微孔板封板后，按照试剂盒说明书中指定的时间进行室温孵育，按步骤4.3.6进行洗涤。4.3.9　加底物每孔加入底物溶液。按照试剂盒说明书中指定的时间进行室温孵育。4.3.10　加终止液每孔加终止液终止反应。4.3.11　测定吸光值（OD值）酶标仪预热15min，在加入终止液5min内读取试剂盒说明书中指定波长的吸光度值。实验有效性检测只有当满足试剂盒说明书规定的条件时检测才有效。结果计算使用试剂盒说明书指定的计算公式进行结果计算。结果判定使用试剂盒说明书规定的判定标准进行结果判定。