T/NAASS 058-2023 牛冠状病毒夹心法酶联免疫吸附试验抗原检测技术规程

内容简介

本文件规定了牛冠状病毒夹心法酶联免疫吸附试验抗原检测的术语和定义、夹心法酶联免疫吸附试验
本文件适用于宁夏养牛场牛冠状病毒夹心法酶联免疫吸附试验抗原检测
3　术语和定义下列术语和定义适用于本文件。牛冠状病毒Bovinecoronavirus,BCV牛冠状病毒属于冠状病毒科，是引起新生犊牛腹泻、成年牛呼吸道感染的重要病原。　夹心法酶联免疫吸附试验Sandwichenzymelinkedimmunosorbentassay,sELISA夹心ELISA法是将已知的特异性抗体包被在固相载体上，加入待测样本和针对该抗原的酶标抗体，其中的相应抗原即可与载体上的抗体和酶标抗体特异结合，洗去未结合的材料和酶标抗体，加入酶的底物，由呈色反应来测定抗原。4　夹心法酶联免疫吸附试验试验准备实验环境、仪器与设备、洗液的制备、稀释液的制备、示踪剂工作液的配制按照试剂盒说明书规定执行。实验环境的生物安全条件应符合GB/T19489的要求，稀释用蒸馏水应符合GB/T6682的要求。检测样品采集牛粪便样品加入等体积的样品稀释液，自然沉淀10min，无需离心，吸取粪便溶液的上清液于1.5mL离心管中。操作程序使用前将所有试剂恢复至18℃～24℃，轻轻摇动或旋转，使试剂混合均匀。4.3.1　取板取出微孔板，并在操作记录表上标记样品的位置。如果使用微孔板的一部分，则只需取出足够检测样品的条数。未使用的微孔板条用锡箔纸包好，保持干燥与密封，2℃～8℃保存。4.3.2　加样每孔加样品，A1与B1孔中加入样本1，C1和D1孔中加入样本2，以此类推。同样方法加入阳性对照（例如G1和H1）。4.3.3　感作将微孔板封板后，按照试剂盒说明书中指定的时间进行室温孵育。4.3.4　洗涤弃去微孔板中液体，用300μL左右的洗涤液洗涤每个板孔3次。在每一次洗涤后，甩去每个板孔中的液体，在洗涤时以及在加入下一步试剂之前要防止反应板出现干燥现象，避免孔内产生气泡，在最后一次甩掉后，在吸水材料上用力扣板，吸去剩余的液体.4.3.5　加酶结合物每孔加入酶结合物，摇匀。密封后按照试剂盒说明书中指定的时间进行室温孵育，按步骤4.3.4的步骤进行洗涤。4.3.6　加底物每孔加入底物溶液。加入孔中的底物溶液必须完全无色。按照试剂盒说明书中指定的时间进行室温避光孵育。4.3.7　加终止液每孔加入终止液终止反应。4.3.8　测定吸光值（OD值）酶标仪预热15min，在加入终止液5min内读取试剂盒说明书中指定波长的吸光度值（OD）。实验有效性检测只有当满足试剂盒说明书规定的条件时检测才有效。结果计算使用试剂盒说明书指定的计算公式进行结果计算。结果判定使用试剂盒说明书规定的判定标准进行结果判定。