T/NAASS 044-2022 牛肉中80种药物及代谢物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法

内容简介

本文件规定了牛肉中80种药物及代谢物（参见附录A）残留量的液相色谱-串联质谱检测方法
本文件适用于新鲜或解冻牛肉中80种药物及代谢物的残留量测定
术语和定义下列术语和定义适用于本文件。药物及其代谢物残留residuesofdrugsandtheirmetabolites指动物用药后，动物产品的任何可食用部分中所有与药物有关的物质的残留，包括药物原形/和其代谢产物。[GB31650，术语和定义3.1]基质效应matrixeffect指样品中除分析物以外的其他成分对分析物测定值的干扰，基质效应包括正效应和负效应。基质匹配matrixmatching指为了消除仪器分析中的基质效应，在制备标准品时要保证其含有的基质当量水平和经过前处理的样品里面的相同。质谱监测参数massspectrometrymonitoringparameters指质谱仪测定每一种药物及其代谢物时所需要的条件参数，包括化合物的定性离子对、定量离子对、锥孔电压及碰撞能量等值。原理试样中80种药物及代谢物用甲酸乙腈水溶液提取，经固相萃取柱净化，高效液相色谱-串联质谱法测定，基质匹配外标法定量。试剂与材料除非另有说明，在分析中仅使用分析纯的试剂，水为GB/T6682规定的一级水。试剂乙腈(CH3CN)：色谱纯。甲酸(HCOOH)：色谱纯。甲醇(CH3OH)：色谱纯。溶液配制乙腈-水溶液（8+2，体积比）：量取200mL水加入800mL乙腈中，混匀。提取液：量取2mL甲酸（5.1.2）用乙腈-水溶液（5.2.1）稀释至1000mL。甲醇-水溶液（1+9，体积比）：量取10mL甲醇加入90mL水中，混匀。溶解液：取0.1mL甲酸（5.1.2）加入100mL甲醇-水溶液（5.2.3）中，混匀。流动相A：取甲酸（5.1.2）1mL，用水稀释至1000mL。流动相B：取甲酸（5.1.2）1mL，用甲醇稀释至1000mL。标准品80种药物及代谢物标准品，参见附录A，纯度≥95%。标准溶液的制备标准储备液（1mg/mL）：准确称取80种药物及代谢物标准品各约10mg（精准至0.1mg），分别置于10mL棕色容量瓶中，根据药物溶解度选择甲醇、乙腈水溶解并定容至刻度（溶剂选择参见附录A），混匀，配制质量浓度为1mg/mL的标准储备液，-20℃冰箱保存，有效期为6个月；混合标准溶液（1μg/mL）：准确量取1mg/mL的80种药物及代谢物标准储备液各50μL，于50mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，混匀，配制成质量浓度为1?μg/mL的混合标准工作液。-20℃冰箱保存，有效期3个月。混合标准溶液（100ng/mL）：准确量取1mL混合标准溶液（5.4.2）于10mL容量瓶中，用溶解液（5.2.4）稀释至刻度。该溶液2℃～8℃保存，有效期3个月。材料OasisPRiMEHLB固相萃取柱：200mg，6mL。微孔滤膜：0.22?μm。仪器和设备超高效液相色谱-串联质谱仪：配电喷雾离子源。分析天平：感量0.01g和0.00001g。高速离心机：转速不低于10000r/min。涡旋混合器。氮吹仪。试料的制备试料制备取适量新鲜或解冻的空白或供试样品，剔除样品中的筋膜及脂肪组织后放入绞肉机或均质仪中搅碎并均质，装入洁净的密封袋或密封盒中，标明标记。取均质后的供试样品，作为供试试料。取均质后的空白样品，作为空白试料。取均质后的空白样品，添加适宜浓度的标准工作液，作为空白添加试料。试料的保存-20℃冷冻保存。测定步骤提取称取2.5g（准确至0.01g）均质好的牛肉样品，置于50mL聚丙烯离心管中，加入提取液（5.2.2）10.0mL，旋涡振荡，12000r/min高速离心5min，取上清液待净化。净化取OasisPRiMEHLB固相萃取柱，无需活化与平衡，将3.0mL上清液过固相萃取柱，保持一秒一滴的流速，收集全部流出液，然后再准确量取2mL流出液，氮气下吹干，1mL溶解液（5.2.4）溶解，过0.22?μm微孔滤膜，待超高效液相色谱-串联质谱测定分析。基质匹配标准曲线绘制取空白样品，按上述方法处理制得基质空白溶液，准确量取混合标准工作液（5.4.3）适量，用基质空白溶液稀释配制成浓度为1μg/L、2.5μg/L、5μg/L、25μg/L、50μg/L的基质匹配系列标准工作溶液，现用现配，供超高效液相色谱-串联质谱测定。测定液相色谱参考条件：a）色谱柱：WatersHSST3色谱柱(2.1mm×100mm×1.8μm）；b）　柱温：45?C；c）　样品温度：10?C；d）　进样量：2μL；e）　流速：0.45mL/min；f）　流动相：A为甲酸体积分数为0.1%的甲酸水溶液（5.2.5）B为甲酸体积分数为0.1%的甲酸甲醇溶液（5.2.6），梯度洗脱程序见表1。液相色谱的梯度洗脱程序t/min　V（流动相A）/%　V（流动相B）/%0　98　20.25　98　212　2　9813　2　9813.01　98　217　98　2质谱参考条件：a）　离子源：电喷雾离子源（ESI+）；b）　扫描方式：正离子扫描；c）　采集模式：多反应离子监测（MRM）；d）　毛细管电压：3.5V；e）　脱溶剂气温度：600℃；f）　锥孔气流速：150L/h；g）　离子源温度：150℃；h）　脱溶剂气流速：1000L/h；i）　碰撞气流速：0.15mL/min。j）　药物及其代谢物的质谱监测参数见附录A.2。测定法取基质匹配标准溶液和试样溶液，作单点或多点校准，按外标法，以峰面积计算。基质匹配标准溶液及试样溶液中80种药物的峰面积均应在仪器检测的线性范围之内。试样溶液的保留时间在基质匹配标准溶液保留时间的±5%之内。试样溶液中的离子相对丰度与基质匹配标准溶液中的离子相对丰度相比，符合表2的要求。基质匹配标准溶液中总离子流图见附录B。试样溶液中离子相对丰度的允许偏差范围相对丰度（%）　允许偏差（%）＞20～50　±25＞10～20　±30≤10　±50空白试验除不加试料外，采用完全相同的步骤进行操作。结果计算和表述试料中待测药物的残留量按式（1）计算：X=(f×C_s×A×V)/(A_s×m)………………………………………………………（1）式中：X—供试试料中相应药物残留量，单位为微克每千克（μg/kg）；f—稀释倍数；Cs—标准溶液中相应药物浓度，单位为微克每升（μg/L）；A—试样溶液中相应药物的色谱峰面积；As—标准溶液中相应药物色谱峰面积；V—溶解残余物所用的溶液体积，单位为毫升（mL）；m—供试试料质量，单位为克（g）；计算结果需扣除空白值，测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留三位有效数字。检测方法定量限、准确度和精密度定量限本方法定量限见附录A。准确度本方法在牛肉中2.0μg/kg～100μg/kg添加浓度的回收率为60%～120%。精密度本方法批内相对标准偏差≤15%，批间相对标准偏差≤20%。