T/CI 160-2022 极端环境真菌的分离、培养、保藏和应用技术指南

内容简介

本文件提供了极端环境真菌（以下简称“极端真菌”）的来源，分离、培养、鉴定、保藏方法和生物技术应用指南
本文件适用于极端真菌的分离、培养、鉴定、保藏与应用
极端环境真菌extremeenvironmentalfungi在常见普通真菌无法生存的极端环境条件下（如高温低温、高盐、高毒素、缺水、脱水、低氧厌氧、高低压强等）能够正常生长、发育、繁殖的真菌。注：　常见的普通真菌一般生长在温度22℃～36℃，湿度95％～100％，pH5～6.5的有氧环境。普通真菌对高/低温度、高渗透（高盐与脱水）、高毒素、低氧或厌氧、高低压强等敏感、适应性差。3.2　嗜冷真菌psychrophilicfungi最适生长温度小于等于15℃、最高生长温度小于等于25℃的真菌。3.3　嗜热真菌thermophilicfungi最适生长温度大于等于40℃、最低生长温度大于等于20℃的真菌。3.4　嗜盐真菌halophilicfungi在大于等于5%钠、钾等常规盐离子浓度环境生长最快的真菌。3.5　毒素降解真菌toxin-degradingfungi适宜于在毒素环境生存，具有将呕吐毒素（DON）、黄曲霉毒素（AFT）、玉米赤霉烯酮（ZEN）等毒素降解为低毒或者无毒物质的真菌。3.6　钝化重金属真菌passivateheavymetalfungi适宜于在重金属污染环境生存，具有钝化重金属，使其缓慢氧化或化合，减少离子状态，从而缓解作物吸收的真菌。3.7　重金属heavemetal密度大于4.5g/cm3的金属。注：　在环境污染方面，重金属主要是指汞（水银）、镉、铅、铬以及类金属砷等生物毒性显著的重元素。重金属非常难以被生物降解，相反却能在食物链的生物放大作用下，成千百倍地富集，最后进入人体。重金属在人体内能和蛋白质及酶等发生强烈的相互作用，使它们失去活性，也可能在人体的某些器官中累积，造成慢性中毒。2018年我国颁布的《土壤环境质量农用地土壤污染风险管控标准（试行）GB15618-2018》和《土壤环境质量建设用地土壤污染风险管控标准（试行）GB36600-2018》规定了土壤环境重金属污染上限指标，超过此指标即存在影响人类健康的危害，需要及时的修复和风控。砷在第一类土地中不能超过120mg/kg,第二类土地中不能超过140mg/kg。镉在第一类土地中不能超过47mg/kg，在第二类土地中不能超过172mg/kg。铬在第一类土地中不能超过30mg/kg，在第二类土地中不能超过78mg/kg。铅在第一类土地中不能超过800mg/kg，在第二类土地中不能超过2500mg/kg。汞在第一类土地中不能超过33mg/kg，在第二类土地中不能超过82mg/kg。5　试剂和材料5.1　除另有规定外，试剂为分析纯和蒸馏水。5.2　DNA胶回收试剂盒、各种毒素ELISA检测试剂盒、毒素荧光定量快速检测试纸条。5.3　2xTaqPCRStarMix：pcr预混液。5.4　极端真菌鉴定引物对ITS1和ITS4。5.5　50×TAE电泳缓冲液：称取242.0gTris-base、37.2gEDTA-Na2·2H2O、57.1mL冰醋酸，溶解于适量蒸馏水中，用10MNaOH溶液调节pH=8.3，补充水分定容至1000mL，室温保存。使用时需将50×TAE稀释为1×TAE。5.6　30%无菌甘油：水：甘油=7:3，121℃灭菌15min。5.7　CTAB溶液：称取20gCTAB、29.2gEDTA-Na2·2H2O、1MTris-HCl100mL(pH=8.0)、5MNaCl280mL，溶解于适量蒸馏水中，补充水分定容至1000mL，1%的β-巯基乙醇（现用现配），室温保存。5.8　氯仿异戊醇混合液：氯仿：异戊醇体积比为24:1，在通风橱中，将异戊醇加入到氯仿中混合均匀即可。5.9　10MNaOH溶液：称取400gNaOH，溶解于适量蒸馏水中，补充水分定容至1000mL，配制成10M的NaOH溶液。5.10　PBS磷酸盐缓冲液：称取8gNaCl、0.2gKCl、1.44gNa2HPO4和0.24gKH2PO4，溶解于适量蒸馏水中。用盐酸调节pH=7.4，补充水分定容到1000mL，用0.22um的微孔滤膜抽滤灭菌。4℃保存。5.11　琼脂糖凝胶：称取10g琼脂糖，缓慢加入1×TAE缓冲液，加热使之充分溶解，配制成10g/L的琼脂糖凝胶。5.12　PDA培养基，按以下步骤制备：a)　称取200g去皮马铃薯，切成小块，加适量水煮沸20min~30min（能被玻璃棒戳破即可），用八层纱布过滤；b)　在过滤液加入18g琼脂粉，继续加热搅拌混匀，待琼脂粉溶解完后，加入20g葡萄糖，搅拌均匀，稍冷却后再补足水分至1000mL，分装玻璃试管或者锥形瓶，用封口膜封口，121℃灭菌15min。液体培养基PDB不加琼脂粉；c)　PDA斜面培养基：分装量为玻璃试管高度的1/4（4mL~5mL），灭菌后趁热摆放斜面，制成斜面培养基，倾斜度为试管中的培养基约占试管长度的1/2。5.13　降解DON筛选培养基：称取1g（NH4）2SO4、3gKH2PO4、6gK2HPO4、0.5gNaCl、0.5gMgSO4·7H2O、0.05gCaCl2、0.001gFeSO4·7H2O、0.05g蛋白胨、20g琼脂粉，溶解于适量蒸馏水中，用盐酸调节pH=6.0~7.0，补充水分定容至1000mL，121℃灭菌15min。灭菌后，待冷却至50℃~60℃时，在无菌操作台里加入抽滤除菌的氧化苯乙烯，终浓度为15mmol/L，趁热倒入培养皿,待培养基凝固即制成脱氧雪腐镰刀菌烯醇筛选培养基平板，置于无菌操作台备用。液体培养基不加琼脂粉。注：　氧化苯乙烯是脱氧雪腐镰刀菌烯醇（呕吐毒素）类似物，可替代DON进行初步筛选高效降解DON毒素真菌。5.14　降解AFT筛选培养基：称取5.0g（NH4）2SO4、2.5gKH2PO4、1.0gMgSO4、0.5gNa2HPO4·12H2O、0.1gCaCl2、20g琼脂粉，溶解于适量蒸馏水中，用盐酸调节pH=6.5，补充水分定容至1000mL，121℃灭菌15min。灭菌后，待冷却至50℃~60℃时，在无菌操作台里加入抽滤除菌的香豆素溶液，终浓度为1g/L，趁热倒入培养皿,待培养基凝固即制成黄曲霉毒素筛选培养基平板，置于无菌操作台备用。液体培养基不加琼脂粉。注：　香豆素是黄曲霉毒素（AFT）类似物，可替代AFT进行初步筛选高效降解AFT毒素真菌。5.15　降解ZEN筛选培养基：称取2.0g(NH4)2SO4、0.5gNaH2PO4、0.5gK2HPO4、0.2gMgSO4、0.1gCaCl2、20g琼脂粉，溶解于适量蒸馏水中，用盐酸调节pH=7.0，补充水分定容至1000mL，121℃灭菌15min。灭菌后，待冷却至50℃~60℃时，在无菌操作台里加入抽滤除菌的赤霉烯酮溶液，终浓度为1g/L，趁热倒入培养皿,待培养基凝固即制成玉米赤霉烯酮毒素筛选培养基平板，置于无菌操作台备用。液体培养基不加琼脂粉。5.16　含有重金属的PDA培养基制备：PDA培养基配方同5.12，调节pH=5.0(防止重金属沉淀),121℃灭菌15min。灭菌后，待冷却至50℃~60℃时，在无菌操作台里加入过滤除菌的重金属溶液，趁热倒入培养皿,待培养基凝固即制成重金属PDA培养基，置于无菌操作台备用。液体培养基不加琼脂粉。5.17　含有NaCl的PDA培养基：PDA培养基配方同5.12，pH值自然，加入NaCl制成不同质量分数（%）的NaClPDA培养基。液体培养基不加琼脂粉。5.18　琼脂粉培养基：称取琼脂粉18g，溶解于适量蒸馏水中，补充水分定容至1000mL，121℃灭菌15min。5.19　培养基的无菌检测：将灭菌后的培养基放在28℃~34℃培养箱中，培养1~3天，检查合格后将其保存于4℃或者室温。