T/SDAA 0045-2021 多杀性巴氏杆菌的检测 PCR 法

内容简介

多杀性巴氏杆菌的检测PCR法1范围本文件规定了猪多杀性巴氏杆菌的PCR检测方法。本方法适用于猪多杀性巴氏杆菌的检测。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范NY/T564-2016猪巴氏杆菌病诊断技术3原理根据多杀性巴氏杆菌的基因序列设计一对特异性引物，以多杀性巴氏杆菌的DNA核酸为模板，扩增特异的目的DNA片段。扩增的DNA片段经琼脂糖凝胶电泳，根据DNA条带的大小来判断结果。4试剂或材料除非另有规定，所用试剂均为分析纯。4.1水：GB/T6682，一级。4.25%绵羊鲜血平板4.3革兰氏染液4.42×TaqMasterMix4.5DNAMarkerDL20004.6琼脂糖4.7TAE缓冲液4.84SGreenPlus无毒核酸染料T/SDAA0045－20215仪器设备5.1生物安全柜：配ULPA超高效空气过滤器。5.2高速冷冻离心机：转速不低于12000rpm/min。5.3PCR仪：最大升降温速率为4℃/秒，温度范围4℃~99℃。5.4凝胶成像仪：图像分辨率不低于500万像素，灵敏性可检测出低于20pgEB染色的双链DNA。5.5紫外透射仪：透射紫外光源波长为302nm。5.6电泳仪，恒压输出范围：3～300V、恒流输出范围：1～400mA、恒功率输出范围：1～120W。6样品按照NY/T541的规定采集、贮存样品。7试验步骤7.1细菌的分离及纯培养7.1.1在生物安全柜内，将无菌采取的患病动物心血用接种环直接在绵羊鲜血平板上划线接种。对采集的肺脏、肝脏或脾脏，用酒精灯火焰烧红的刀片烧烙肺脏、肝脏或脾脏的表面，用无菌手术剪刀在烧烙部位剪开一个小口。酒精灯火焰灼烧接种环，冷却后将接种环从病料的小口处扎入肺脏等内部，挑取少量组织，在5%绵羊鲜血平板上划线接种。接种后的平板贴好标签后放入恒温箱，37℃培养24h，观察菌落大小、形态、溶血状况等。7.1.2猪多杀巴氏杆菌的菌落为圆形、边缘整齐、表面光滑似粘液状、大小为1mm~1.5mm左右，菌落形态参见附录A.1。7.2革兰氏染色与镜检7.2.1取洁净的载玻片，用接种环钩取一环无菌生理盐水在载玻片上涂布呈直径1cm大小的水膜。挑取单个菌落均匀涂抹在水膜内，室温干燥、火焰固定。进行革兰氏染色。7.2.2滴加结晶紫染色液，染色1min~2min，流水缓慢冲洗，干燥；7.2.3滴加革兰氏碘液，染色1min~2min，流水缓慢冲洗，干燥；7.2.4滴加95%的乙醇，脱色10s~30s，流水缓慢冲洗，干燥；T/SDAA0045－20217.2.5滴加复染液，复染1min，流水缓慢冲洗，自然干燥。7.2.6镜检猪多杀巴氏杆菌为革兰氏染色阴性、短小杆菌或球杆菌，细菌形态参见附录A.2。7.3PCR检测7.3.1细菌基因组DNA模板的制备按照NY/T564-2016中4.4.4中的规定制备。7.3.2PCR扩增7.3.2.1引物根据多杀巴氏杆菌16SrRNA基因序列（见附录A.3），设计一对引物，商业合成，引物序列见附录B.1。7.3.2.2PCR反应体系PCR反应体系为25μL体系，见附录B.2。7.3.2.3PCR反应条件样品反应管以2000rpm/min离心1min，置于PCR扩增仪内进行扩增。PCR反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸30s，扩增32个循环，72℃终延伸10min，结束反应。同时设置多杀巴氏杆菌阳性（标准株）和阴性（无菌水）对照。PCR扩增产物用1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳，紫外透射仪或凝胶成像仪观察扩增DNA条带的大小。7.4PCR产物琼脂糖凝胶电泳按NY/T564-20164.4.6规定执行。7.5结果判定7.5.1试验成立的条件参照DL2000DNAMarker中DNA条带的大小，当阳性对照扩增出约355bp片段，阴性对照未扩增出片段，检测结果成立，核酸电泳结果见附录B.3。7.5.2阳性判定符合7.5.1的条件下，被检样品扩增出约355bp的片段，则判定被检细菌为多杀性巴氏杆菌。T/SDAA0045－20217.4.5.3阴性判定符合7.5.1的条件下，被检样品未扩增出约355bp的片段，则判定被检细菌不是多杀性巴氏杆菌。