T/SDAA 0054-2021 动物性食品中 12 种β-受体激动剂类药 物检测技术规范 酶联免疫吸附法

内容简介

动物性食品中12种β-受体激动剂类药物检测技术规范酶联免疫吸附法1范围本文件规定了酶联免疫吸附法（ELISA）检测动物性食品中12种β-受体激动剂类药物残留量的技术规范。本文件适用于猪肉、牛肉、羊肉中克伦特罗、沙丁胺醇、氯丙那林、特布他林、妥布特罗、溴布特罗、马喷特罗、西布特罗、马布特罗、班布特罗、西马特罗和非诺特罗等12种β-受体激动剂类药物总残留量的测定。本文件方法的最低检测限：猪肉、牛肉、羊肉中12种β-受体激动剂类药物总残留量的最低检测限均为1μg/kg。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T33411酶联免疫分析试剂盒通则3原理采用间接竞争ELISA方法，在微孔条上包被克伦特罗抗原，试样中残留的β-受体激动剂类药物与酶标板上的克伦特罗抗原竞争克仑特罗抗体，加酶标记的抗体后，显色剂显色，终止液终止反应。用酶标仪在450nm处测定吸光度,吸光值与12种β-受体激动剂类药物残留总量成负相关，与标准曲线比较即可得出12种β-受体激动剂类药物残留量。T/SDAA0054－20214试剂或材料以下所用的试剂，除非另有规定外，仅使用分析纯试剂4.1水，GB/T6682，三级。4.2氢氧化钠（NaOH）4.3三氯乙酸（C2HCl3O2）4.4氢氧化钠溶液：C(NaOH)=1mol/L，称取氢氧化钠（4.2）40.0g，加水溶解定容至1000mL。4.5三氯乙酸溶液：C(C2HCl3O2)=10g/L，称取三氯乙酸（4.3）10.0g，加1000mL水溶解，摇匀。。4.6β-受体激动剂检测试剂盒2℃～8℃保存。4.6.1包被有克仑特罗抗原的96孔板规格为12条×8孔。4.6.2克仑特罗抗体工作液4.6.3酶标记物工作液4.6.420倍浓缩洗涤液4.6.5底物液A液4.6.6底物液B液4.6.7终止液4.6.8克仑特罗系列标准溶液6个浓度梯度，浓度分别为0μg/L、0.2μg/L、0.6μg/L、1.8μg/L、5.4μg/L、16.2μg/L。4.6.9洗涤工作液用水将20倍的浓缩洗涤液按1:19体积比进行稀释（1份20倍浓缩洗涤液+19份水），用于酶标板的洗涤。2℃～8℃保存，有效期1个月。4.6.10底物液A、B混合液底物液A液、底物液B液按体积1:1充分混匀，混合液在5min内使用，避免使用金属盛装、搅拌混合液。5仪器设备5.1酶标仪配备450nm滤光片。5.2微量移液器单道20μL～200μL、200μL～1000μL微量移液器，8道50μL～300μL微量移液器。5.3均质器转速10000r/min～15000r/min。T/SDAA0054－20215.4微量振荡器适用96孔板。5.5旋涡混合器5.6天平感量为0.01g。5.7离心机转速≥4000r/min。6试样制备样品保存在-20℃冰箱中。取新鲜或解冻的空白样品，剪碎，置于均质器中以10000r/min～15000r/min高速均质1min。7分析步骤7.1样品处理称取试样2g±0.01g于50mL离心管中，加入4mL三氯乙酸溶液（4.5），充分混匀；4000r/min离心5min；取1mL上清液于新的离心管中，加入30μL氢氧化钠溶液（4.4），涡动10s混匀；4000r/min离心5min；取50μL上清液进行检测。稀释倍数为2倍。7.2测定步骤使用前将试剂盒置于室温（19℃～25℃）下放置1h～2h。7.2.1按每个标准溶液和试样溶液分别至少做两份平行试验计算，将所需数目的酶标板条插入板架中，记录各标准溶液和试液的位置。7.2.2加50μL各标准溶液（4.6.8）或试样溶液到各自微孔中。7.2.2加入50μL抗体工作液（4.6.2）到每一微孔中，充分混匀，室温下（25℃±2℃）避光反应15min。7.2.3倒掉孔中液体，每孔加入260μL洗涤工作液（4.6.9），充分洗涤4次，每次浸泡15s～30s。7.2.4倒掉板孔中液体，将酶标板倒置于吸水纸上，拍干；立即在每孔中加入100μL酶标记物工作液（4.6.3），充分混匀，室温下（25℃±2℃）避光反应15min。7.2.5重复步骤7.2.3；7.2.6立即在每孔中加入100μL底物A、B混合液（4.6.10），充分混匀，室温下（25℃±2℃）避光反应15min～20min。7.2.7每孔中加入50μL终止液（4.6.7），充分混匀；终止后5min内用酶标仪在波长450nm处测定吸光度。T/SDAA0054－20217.3空白试验取试剂盒中提供的空白，按7.2测定步骤进行。7.4质控试验每次测定均应做1个用空白试样添加标准溶液的质控样品。8结果计算和表述8.1相对吸光度值用标准溶液和试样溶液吸光度值与空白溶液吸光度值的比值进行计算，见式（1）：Ar=BB0×100%…………………（1）式中：Ar—相对吸光度值，%；B—标准（或试样）溶液的平均吸光度值；B0—空白的平均吸光度值。计算结果保留3位有效数字。8.2绘制标准曲线以相对吸光度值（%）为纵坐标，以各标准溶液浓度（μg/L）的自然对数为横坐标，在半对数坐标上绘制标准曲线。每次试验均需新绘制标准曲线。8.3样品结果计算样品中β-受体激动剂类药物残留总量以X表示，数值以微克每千克（μg/kg）表示，按式（2）计算：X=C×n…………（2）式中：C—从标准曲线上查德的试样溶液中的药物浓度，单位为微克每升（μg/L）；n—试样稀释倍数。计算结果保留三位有效数字。T/SDAA0054－20219.交叉反应克仑特罗：100%。氯丙那林：141%妥布特罗：80%溴布特罗、马喷特罗：107%西布特罗：86.9%。沙丁胺醇：60.6%。马布特罗：56.3%。特布他林：33.1%。班布特罗：18%。西马特罗：14%。非诺特罗：10.6%。10.精密度10.1灵敏度本方法在猪肉、牛肉、羊肉样品中β-受体激动剂类药物残留总量的检测限均为1μg/kg。10.2准确度本方法在1μg/kg～10μg/kg添加浓度水平上回收率均为60%～120%。10.3准确度本方法的批内变异系数≤20%，批间变异系数≤30%。